火影忍者手游大蛇丸试炼模式是一种6人参与的趣味对抗玩法，其中1名玩家会被随机选为实验体（大蛇丸阵营），其余5名玩家组成联军阵营。实验体拥有高血量、霸体状态和强力技能，而联军需要通过团队协作或灵活走位击败实验体或存活至时间结束。胜负判定取决于实验体是否被击杀或联军是否全员被转化，存活时间和伤害输出会影响最终评分奖励。
进入大蛇丸试炼模式需通过游戏主界面奖励面板中的活动日历入口。该模式的地图分为上下两层，中间由帷幕隔开，并设有视野盲区和可交互的机关区域。实验体触发条件存在随机性，部分情况下需在光门场景中击打隐藏的蛇头标记才能激活晓大蛇丸形态。联军玩家需注意实验体的红色反伤护罩机制，在其开启时避免攻击，同时利用地图边缘的楼梯和帷幕进行战术迂回。
推荐优先选用远程消耗型（如赤砂之蝎、白）或位移灵活型（如鬼灯水月、阿飞）忍者，近战体术型忍者因需贴身输出而处于劣势。实验体玩家应注重走位控制，优先占据地图上层或下层边缘，利用二技能的远程特性进行反击。联军玩家需保持分散站位，通过秘卷技能如一字连柱或豪火球进行远程消耗，奥义技能建议在实验体技能真空期释放。
当场景进入黑暗模式时，联军玩家应避免聚集在中央区域，可退至楼梯处减少被实验体命中的概率。实验体玩家则需把握黑暗时机，利用视野差发起突袭。若联军成员被实验体击杀，会转化为次级实验体协助作战，存活的联军玩家应及时调整策略，优先清理次级实验体再集火主目标。评分系统会综合存活时长、伤害量和击杀数，因此合理控制输出节奏比盲目进攻更有效。
该模式奖励包括秘卷碎片、声望和金币，通过累计积分解锁宝箱获取。对于追求效率的玩家，可优先完成前三名任务目标，选择具备爆发输出的忍者快速积累伤害值。若追求稳定性，则建议选用位移型忍者专注生存。需注意该模式存在概率性BUG，如角色异常卡入墙体等，遇到时应及时重启对局避免影响体验。
